从美洲苦木属植物Picramniaglazioviana中分离得到的降三萜类化合物
一、文章摘要
本文作者通过采用HPLC-PDA-HRMS-SPE-NMR分析，靶向指导高效液相色半制备从P.glazioviana乙纯提取物的CH2Cl2层馏分中分离得到降三萜类成分。共分离得到18个新的降三萜类化合物，并将他们命名为picravianesC-T。通过核磁数据分析，计算化学计算，并结合他们的生合成途径，确定了大多数化合物的绝对构型。在药理方面对化合物进行了细胞毒性筛选，所筛选的三种活性中均没有得到好的结果。
二、背景介绍
植物简介：
Picramniaglazioviana为美洲苦木属中的一种植物。美洲苦木属与美洲臭椿属，被一同归入美洲苦木科。美洲苦木属为美洲苦木科中形态为灌木或小树的一个小属，由大约40种植物组成，常分布在美洲热带地区，即从美国，墨西哥，中美洲到南美洲的哥伦比亚，委内瑞拉，秘鲁，巴西，巴拉圭和阿根廷。该植物在传统上被用于治疗皮肤病和蠕虫。其中含有的化学成分主要包括蒽醌类，蒽酮类，蒽酮苷类，黄酮类和三萜类化合物。
柠檬苦素类化合物：
“柠檬苦素类似物”一词源于柠檬或其他柑橘类水果的苦味。从结构上来说，柠檬苦素类化合物是由甘遂烷型类三萜骨架中侧链的四个末端碳缺失形成的，然后环化形成17β-呋喃环，因此柠檬苦素类化合物也被称为四降萜类化合物。植物界中的柠檬苦素类主要存在于楝科和芸香科中，楝科有50个属和多个种，分布在世界各地的热带和亚热带地区。作为楝科的特有天然产物，柠檬苦素类在化学和生物研究界引起了极大的兴趣。印度苦楝树是楝科最著名的含有柠檬苦素类化合物的植物之一，长期以来被认为是环境友好型生物农药的来源。
HPLC-SPE-NMR联用技术：
为了加速基于天然产物的药物发现，需要直接从粗植物提取物中对主要和次要生物活性成分进行全面结构解析和/或指导(半)制备规模高效液相色谱分离的分析方法，高效液相色谱-固相萃取-核磁共振技术应运而生。高效液相色谱-固相萃取-核磁共振技术，是在高效液相色谱-质谱联用技术的支持下的一种鉴定粗提物的多种成分进行植物化学分析的一种有价值的技术。其优点在于HPLC-SPE-NMR联用技术能从所有可识别的HPLC峰获得NMR数据，通过多次SPE收集极大地改善了NMR谱的信噪比，比直接的HPLC-NMR实验提高了10倍。该方法允许在线生成高质量的2D核磁共振数据，而无需传统的萃取成分纯化，这代表了天然产物研究在结构阐明方面的转变。HPLC-SPE-NMR联用技术具有显而易见的灵敏性，其建立了天然产物研究的新范例；不经制备分离，就可快速、精确测定包括次要成分在内的多个提取组分的结构。通过这种基于在线联用技术的化学筛选可以高效全面获取整个天然产物混合物中的化学成分信息，包括结构类型、含量和可能的结构信息等。通过滤除掉已知重复的结构，锁定具有新颖结构或感兴趣的目标成分，避免了传统研究工作中的重复性、盲目性、耗时性。实现了有目标的锁定，有目的分离，极大地提高了工作效率，避免了巨大的资源浪费。
其使用原理是首先在反相色谱柱上用非氘化洗脱液梯度洗脱分离混合物成分后，使用光电二极管阵列检测器（质谱仪-质谱仪）记录色谱图。然后加水将HPLC柱洗脱液进行柱后稀释，并将色谱峰中存在的分析物捕集在各个固相萃取（SPE）柱上，捕集受PDA或MS检测器的信号控制。最后将SPE小柱用氮气流干燥，最后将分析物用氘化溶剂洗脱到NMR流动探针中，得到分离开的化合物。
三、文章内容
HPLC-PDA-HRMS-SPE-NMR分析：
首先将溶于甲醇-H2O(1∶3)中的美洲苦木P.glazioviana的乙醇提取物依次用己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯进行萃取。
将干燥的二氯甲烷馏分随后在甲醇中再溶解至浓度为mg/mL。使用C18柱进行高效液相色谱-质谱-固相萃取-核磁共振分析，经过八次重复的高效液相色谱分离后，将峰1、2、4、6-10、14、15和17-21累积在固相萃取柱上。以峰10为例，通过该联用系统可以在线得到的该峰的一维二维核磁，以及紫外和质谱信息。
从该分析中获得的紫外光谱和HRMS图中，可以得到这些成分分别是C-29降三萜(峰2、4、9和10)、乙酰化降三萜(峰1、6、8、14和20)、苯甲酰化降三萜(峰18和19)或乙酰化和苯甲酰化降三萜(峰15、17和21)。其中峰20和22洗脱的成分为已知化合物picravianeA和picravianeB。
结构解析：
采用一维和二维核磁确定了其平面结构。
利用NOESY光谱确定了1的相对构型。然而，E环的自由旋转性导致无法通过NOE确定整个结构的相对构型。因此，采用了VCD光谱的密度泛函理论计算，最终确定化合物1的绝对构型。
生合成途径的推导:
以齐墩果酸为起始，齐墩果酸3位开环氧化得到A，A的1位和25位发生氧化，1位羟基与4位羟基脱水成醚成环，25位羟基与3位羧基酯化成环得到结构C，C发生烯丙位氧化，18位H氧化成羟基，形成D，D脱羧后形成E，E再次发生烯丙位氧化得到F，F发生拜耳-维利格氧化反应，将原来的羰基氧化成酯，得到了具有七元环的G结构，通过进一步的氧化得到了化合物picravianeA和picravianeB。
药理活性：
作者对化合物6、10、14、16-19、21进行了三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-，过表达乳腺癌细胞系SKBR-3Her2和肺肿瘤细胞系A进行了细胞毒性测试，其结果IC50值均大于10，认为其均没有活性。
四、全文总结
作者通过采用HPLC-PDA-HRMS-SPE-NMR分析,导向分离得到大量降三萜类成分，并对其进行了药理活性的测试筛选，为今后对该类化合物的分离和活性筛选等提供了一定的方向与选择。
五．讨论
本篇文章亮点在于采用HPLC-PDA-HRMS-SPE-NMR分析的方法进行导向分离。相比之前所学习过的各种导向分离手段，该方法可以直接获得目标类型化合物，直接获取核磁数据谱图，可以更加高效的分离鉴别化合物。该方法更适用于对植物中次要产物或微量成分的分离鉴别。但同时该方法的局限性也是在于无法大量获取化合物，对于其后续的研究具有一定的局限性。在今后的实验中，我们可以参考应用该方法，快速高效的获取目标化合物，或作为一定的分离指导提高分离效率。
指导教师：黄肖霄
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本文编辑：佚名
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